离子通道在神经传导、肌肉收缩和细胞信号转导等关键生物学过程中发挥重要作用，其开闭状态受电压、配体或机械力等特定刺激的精确调控。从头设计能够响应外界刺激并发生构象变化的跨膜蛋白，是蛋白质工程领域的重要目标，也是技术难点。由于蛋白质动态结构设计的复杂性，实现具有自定义门控功能的跨膜离子通道从头设计，目前仍是一项尚未突破的挑战。成功设计出可响应特定刺激的动态跨膜蛋白，不仅有助于深入理解膜蛋白的工作机制和膜生物学的基本原理，还将拓展其在生物医学与生物技术中的广泛应用前景，带来全新的发展机遇。

北京时间2025年10月16日23时，西湖大学生命科学学院遗传物质表达与重构全国重点实验室卢培龙研究团队，联合西湖实验室/西湖大学李波、黄晶等团队在Cell期刊发表题为“De novo designed voltage-gated anion channels suppress neuron firing”的研究论文。经过六年系统攻关，研究团队在国际上首次实现了电压门控阴离子通道（de novo designed voltage-gated anion channels, dVGACs）的精确从头设计。该人工通道的离子选择机制与电压响应机制均不同于天然离子通道。研究通过生化分析、冷冻电镜结构解析、膜片钳电生理记录及分子动力学模拟，全面验证了其结构与功能，并在小鼠模型中证实其可有效抑制神经元电活动。该成果不仅表明科学家已具备从头设计具有“动态开关”功能的跨膜蛋白的能力，更证明此类人工蛋白可在活体动物中发挥生理作用，标志着人工智能驱动的生物分子设计向实际应用迈出了关键一步。

从头设计电压门控离子通道面临四大挑战：其一，跨膜区域引入带电氨基酸是实现电压响应的关键，但此类残基在疏水环境中能量不利，易影响蛋白稳定性；其二，需精确模拟不同膜电位下门控氨基酸的构象变化；其三，人工通道的离子选择性与电压敏感性应具备可调控性；其四，必须确保蛋白质核心的氨基酸相互作用足以稳定跨膜孔道结构，并维持其在脂质膜中的功能性构象。

从头设计含15次跨膜螺旋的五聚体蛋白

研究团队采用参数化方程与片段组装相结合的方法，从头设计了一个由15根α螺旋组成的五聚体跨膜蛋白骨架TMH3C5，形成两层同心环结构，每个亚基包含3根α螺旋。为拓展结构多样性，研究人员进一步通过采样α螺旋沿y轴的倾斜角θ，构建出具有漏斗状孔道的内环螺旋束。该结构的超螺旋半径沿中心轴动态变化，更有利于通过孔道内部门控氨基酸的构象调整实现孔径调控（图1）。

图1. 从头设计含15根α螺旋的五聚体跨膜蛋白

随后，团队利用ProteinMPNN设计可溶性蛋白的氨基酸序列，并通过AlphaFold2预测其三维结构，筛选出与目标模型高度匹配的候选序列。在此基础上，通过重设计候选蛋白的表面残基，将其亲水表面转化为疏水表面，最终获得8个结构与预测模型高度一致的跨膜蛋白设计体。这些蛋白的基因被合成并在大肠杆菌中成功表达，其中跨膜蛋白tmZC8表现出良好的性质。为解析其三维结构，研究团队将tmZC8与KCTD1蛋白的同源五聚体BTB结构域在N端融合，构建融合蛋白tmZC8-BTB。冷冻电镜解析结果显示，tmZC8-BTB的整体结构与设计模型高度吻合，跨膜区Cα原子的RMSD仅为1.33 Å（图2），验证了设计的准确性。

图2. tmZC8-BTB冷冻电镜结构与设计模型的比较

从头设计电压门控阴离子通道dVGAC

研究团队在从头设计的跨膜五聚体蛋白tmZC8-BTB的孔道内引入带电氨基酸（如精氨酸，Arginine），作为门控残基，以赋予其电压敏感性和离子选择性。孔道中的精氨酸残基形成一个狭窄区域，兼具电压感应和离子选择功能：既作为电压传感器（voltage sensor），又充当离子选择过滤器（selectivity filter）。膜片钳实验表明，其中一个设计变体tmZC8-3R-BTB（含R157、R161和R165三个精氨酸突变）表现出显著的电压依赖性电流。当膜电位超过40 mV时，电流迅速上升，表明通道开放（图3A–3D）。该通道高度选择性地通透氯离子，几乎不传导钠离子等阳离子，阴离子通透顺序为 Cl⁻ > Br⁻ > F⁻ > NO₃⁻ > I⁻（图3E–3H）。单通道记录显示，tmZC8-3R-BTB的单通道电流与电压呈线性关系，表明其单通道电导恒定；但通道开放概率随电压升高而增加，说明电压通过调节开放概率实现门控。上述结果证实tmZC8-3R-BTB是一种从头设计的电压门控阴离子通道，因此被重新命名为dVGAC（de novo designed Voltage-Gated Anion Channel，图3I–3K）。随后，研究团队解析了dVGAC的冷冻电镜结构，分辨率达2.9 Å。结构分析显示，其实际构象与设计模型高度一致，跨膜区Cα原子的RMSD仅为1.09 Å，验证了该通道的精确从头设计。电镜结构中，精氨酸R157的侧链构成孔道最窄处，最小半径为0.5 Å，小于氯离子的半径（约1.8 Å），表明该结构对应于通道的关闭状态（图4）。为进一步探究门控机制，研究团队开展了不同电压条件下的分子动力学模拟。结果显示，dVGAC的主链结构在电压变化下保持稳定，而精氨酸约束区的侧链则呈现构象变化。模拟还再现了实验观察到的氯离子选择性通透、阳离子阻断以及电流随电压升高的现象，与设计原理高度一致。

图3.电生理实验验证

图4. 冷冻电镜结构验证

dVGAC1.0抑制小鼠大脑神经元活动

由于离子通透性对孔道的化学环境和几何结构高度敏感，研究团队通过改变孔道内的氨基酸残基，成功调控了dVGAC的离子选择性与电压敏感性。他们在孔道不同位点引入带电氨基酸突变，发现dVGAC的L153R突变体表现出与dVGAC不同的阴离子选择顺序：Cl⁻ > Br⁻ > I⁻ > NO₃⁻ > F⁻（图5A–5E）。尤为值得注意的是，dVGAC的R165D突变体（命名为dVGAC1.0）在仅20 mV的膜电位下即可激活，并介导显著电流，且离子选择性顺序与dVGAC保持一致（图5F–5J）。由于许多神经元在产生动作电位时膜电位可超过20 mV，这提示dVGAC1.0有望用于调控神经元活动。为此，研究团队将表达人工设计离子通道tmZC8-BTB、dVGAC或dVGAC1.0的腺相关病毒（AAV）注射至Prkcd-cre小鼠的杏仁核中央核（CeA）。结果显示，这些设计通道均能在CeA神经元中高效表达（图5K–5L）。更重要的是，表达dVGAC1.0的神经元放电频率显著降低，而表达dVGAC的神经元放电特性与邻近未感染细胞无异（图5M–5O）。该结果证实，从头设计的电压门控阴离子通道在生理条件下具备调控神经元活动的能力，为开发用于调控细胞及神经功能的人工通道蛋白药物提供了新思路。

图5. dVGAC离子选择性与电压敏感性的调控特性

该研究在从头设计功能性跨膜蛋白方面取得重要突破，实现了从以往仅能构建“静态”膜蛋白结构，到如今可设计具有“动态”响应能力、能对外界刺激产生构象变化的跨膜蛋白的跨越。这类新型蛋白可像“分子开关”一样，根据环境变化切换构象，在细胞中执行特定功能。研究团队成功从头设计出可由基因编码的电压门控阴离子通道dVGACs，并在哺乳动物细胞和神经元中验证了其功能，展现出调控细胞及神经活动的巨大潜力。值得注意的是，dVGACs的电压激活阈值可按需调节，从而实现对神经元活动的精确控制（图6）。该成果为构建响应特定分子或物理信号的新型跨膜蛋白提供了可行路径，具有广泛的应用前景。

图6. 从头设计可控制神经元活动的电压门控阴离子通道dVGACs

西湖大学博士生周晨、博士生李辉灿和博士生王佳兴为该论文的共同第一作者。西湖大学卢培龙研究员为最后通讯作者，吴坤博士、黄晶研究员、讲席教授李波为共同通讯作者。特别感谢西湖大学博士生钱程、熊晖博士、初智霖博士、邵齐明博士、李轩博士、硕士生孙诗津、孙科博士、清华大学靳雪芹博士以及浙江大学杨帆教授等为该研究做出的贡献。